当前位置:首页 >> 电脑基础

pcr如何设置对照(PCR对照)

pcr如何设置对照(PCR对照)

1. PCR对照

荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计算。举例如下:对照组基因A的CT值为20, 内参:比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18,内参CT值14。

如果是realtime做表达量,用excel的制图,将每个个体的Ct值平均数做出柱状图就可以了。如你还做了标曲,就用制图中的散点图看R2值。其实这些功能做定量PCR的时候电脑程序应该会自动分析才对,具体情况具体分析。

2. pcr对照抹带

实时荧光定量PCR 是将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

3. pcr对照组作用

PCR实验室污染原因有四个方面:

(一) 标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染

(二) PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

(三) PCR扩增产物污染:因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性。

还有一种可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;

(四) 实验室中克隆质粒的污染:

防止污染解决办法:

(一) 划分操作区:目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:

1. 试剂准备区。

2.标本制备区。

3. PCR扩增区及分析区。

(二) 分装试剂:PCR扩增所需要的试剂均应在生物安全柜、装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA:

(三) 实验操作注意事项

尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:

1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;

2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;

3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;

4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;

5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;

6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;

7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器。

4. pcr对照组结果必须是1吗

.

原因:科学研究中对研究对象有影响、作用或处理意义的条件有一个或多个,但只探究其中某个对实验对象有影响或作用。通过设置对照实验,既可排除无关因素(无关变量)对自变量的干扰,又可增加实验结果结论的可信和说服力。

2.阴性对照是肯定不会出现预期结果的组。做到“度肯定”需要精密的实验设计、高度可靠的预实验以及实验者的操作。

3.阳性对照是为了说明新疗法的有效性。与阴性对照相比,阳性对照是与要进行的实验。

5. pcr对照组值为1

1、如何看荧光定量PCR的结果

按公式计算:对照组-Ct =对照组(Ct 目的基因-Ct 内参基因)-对照组(Ct 目的基因-Ct 内参基因)

2、荧光定量PCR的结果(CT值)怎么分析

目的基因荧光达到阈值时的循环数~Ct值越低代表起始模板数量越大~

3、miRNA荧光定量PCR结果怎么看

荧光定量我用罗氏的反应速度算是相当快的,在样本处理(提出核酸)后,放在荧光定量PCR仪器上一般需要30分钟~1小时左右.但是如果你的样本比如支原体的含量非常高,可能在没有运行结束已经可以看出结果了,但是如果说5分钟就出结果了,确实太快了点.如果是realtime做表达量,用excel的制图,将每个个体的Ct值平均数做出柱状图就可以了。如果你还做了标曲的话,就用制图中的散点图看R2值。 其实这些功能做定量PCR的时候电脑程序应该会自动分析才对。 具体情况具体分析。

4、如何分析荧光定量pcr实验结果?

如果是realtime做表达量,用excel的制图,将每个个体的Ct值平均数做出柱状图就可以了。如果你还做了标曲的话,就用制图中的散点图看R2值。

其实这些功能做定量PCR的时候电脑程序应该会自动分析才对。

具体情况具体分析。

Www.nfYSW.&CoM

5、乙肝dna荧光定量PCR结果怎么看病毒数量

8.66表示lg(病毒数)=8.66、即病毒数=10^8.66=457088189.6拷贝

参考范围是0-3即0-1000拷贝

检测结果已超出参考范围,表明乙肝病毒呈阳性

6、荧光定量pcr扩增结果怎么表示

实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。

检测指标是:各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

原理:

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

7、实时荧光定量PCR与普通PCR的区别是什么?结果有何异同?能说明的问题是什么?

二者结果相同。都能说明生物体外的特殊DNA复制的整个过程的扩增效率和溶解温度情况。

6. pcr对照基因

PCR是生命科学研究,特别是分子生物学领域的一个重要基础技术,基因测序则是一个集合了微流控、光学、PCR等多种基础技术形成的一个应用技术。

先回答题主的几个问题:

1.PCR扩增需要特定的起点和终点,对应的就是上下游引物之间的目的扩增片段;

基因测序打断后还要进行接头连接,就是给所有打断的DNA片段加上统一的头和尾;

所以所有的PCR不是对应某个特定的基因位点,而是全部对应加上的通用接头(adapters),所以保证了所有的片段都可以被扩增到。

2.PCR跟基因测序的概念在实际对用户宣传中,都会扩大了基因测序的概念,PCR只能进行基因检测,即检测特定片段是否存在,从而推断基因是否发生突变,举个例子,假设某个基因的第200个碱基存在突变A-G两种可能,我们可以设计特定的引物,让有A突变的基因可以扩增出来,G突变的基因无法被扩增,这样我们就可以通过对PCR产物的分析来确定该基因是A型还是G型,这是基因检测行为。而基因测序行为则是直接把该位点的碱基检测出来,从而来确定该位点是A-T-C-G的某一种。

总的来说,PCR的基因检测只能对已知的突变进行检测,而基因测序可以直接测定该位置的基因序列,即还可以发现未知的突变。

7. pcr对照组有没有error bar

pcr条带位置不对,说明pcr产物大小与预期不一致,要么变大了,要么变小了。其本质原因只有一个,pcr扩增是非特异性的扩增。

pcr非特异性扩增的原因有几个方面:

1.模板DNA或rna不对,包括模板污染,目标基因突变(部分缺失或有插入突变);2.引物特异性不强或引物设计错误;3.pcr反应体系退火温度偏低,导致非特异性扩增。

8. pcr对照菌群跑出条带

肠道菌群的检测可通过粪便培养进行。通常情况下,人体新排出的粪便被放入一种特殊的细菌培养基中进行细菌培养。通过对细菌的培养可以知道细菌的种类和每种细菌的具体数量。正常情况下,人体肠道中的细菌种类相对固定,细菌在各种细菌中所占的比例相对固定。各比例的细菌相互作用,维持正常肠道菌群环境,保证肠道正常功能。如果发现细菌种类比例或数量失衡,一些病原菌的过度生长会影响肠道的正常功能,并出现腹泻等症状